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硫化氢在大鼠烧伤休克后应激反应中的作用
一、研 究 内 容 和 意 义
探讨大鼠重度烧伤休克后气体信号分子硫化氢(h2s)血清中的变化对烧伤休克后早期应激反应的影响，主要表现为血管活性物质(组胺、p物质)和大鼠心率、血压的变化，为重度烧伤早期的休克应激反应引入新的理论机制，为烧伤后抗休克治疗寻找新的研究方向。78只雄性sd大鼠，随机分为非烧伤组和烧伤组。烧伤组又分为单纯烧伤组、nahs组、ppg组。烧伤组大鼠制成30%三度烫伤后，在6h、12h、24h、48h、96h各时项点采集血清。采用敏感硫电极法测定血清h2s浓度，采用试剂盒分析仪分析血清中血管活性物质(组胺、p物质)变化，采用16道生理指标测量仪测定大鼠心率、血压。单纯烧伤组血清硫化氢浓度较非烧伤组明显升高。单纯烧伤组、nahs组、ppg组两两比较均有差异。烧伤后大鼠不同时期血清硫化氢浓度不同。不同硫化氢浓度下血管活性物质表达不同。硫化氢可能参与并抑制烧伤休克后应激过程，为重度烧伤后抗休克治疗提出新的研究方向。
二 、选题依据
阐述该选题的研究意义，分析和该研究课题有关的国内外研究概况和发展趋势。
近年来研究发现，生理浓度的硫化氢(hydrogensulfide，h2s)具有多种的生理功能，与气体分子 no、co在部分生物学功能方面相同或相似，因此它被看作体[1]内第三种的气体信号分子 ，在多个系统中具有重要的病理生理学意义，已成为国内外医学研究的热点。研究已发现它在高血压、缺氧性肺动脉高压等疾病的发病过程中具有重要的作用。然而对疾病情况下的 h2s作用的认识则刚刚起步。本实验通过外源性h2s干预烧伤后大鼠，观测大鼠重度烧伤休克后早期应激反应中两种血管活性物质(组胺、p物质)和大鼠心率、血压的变化，从而进一步了解硫化氢在重度烧伤休克后早期应激过程中的作用。
2、国内外主要参考文献(列出作者、论文名称、期刊名称、出版年月)
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三 、研究内容、创新之处
1、选题的目的、研究内容：
硫化氢作为第三种气体信号分子应用于各领域的多方面研究，并得出可观的研究成果。气体信号分子具有多种病理生理作用。近年来，不少研究人员纷纷开始了气体信号分子在烧伤中，尤其重度烧伤后全身应激反应中作用的研究。并取得具有一定价值的研究结果。目前，气体信号分子尤其是硫化氢在烧伤方面的研究尚且不足，有待做出更多的相关研究。以更多了解硫化氢等在烧伤休克应激反应中的应用价值。
本实验应用大面积烧伤大鼠模型 ，通过对外源性硫化氢干预重度烧伤大鼠对血清中血管活性物质(组胺、p物质)表达的影响和大鼠心率血压的改变，探讨其与烧伤休克后应激反应的关系，为临床严重烧伤后抗休克治疗寻求可能有效的治疗药物提供实验依据，也为对硫化氢的进一步研究提供实验数据。
2、意义及创新之处：
⑴首次研究h2s是否参与了烧伤休克早期应激的病理生理过程。
⑵研究烧伤休克后血清中血管活性物质(组胺、p物质)表达的变化规律。
⑶为严重烧伤早期应激过程引入新的理论机制，为烧伤抗休克治疗寻找新的研究方向。
3、应用前景：
第三种内源性气体信号分子h2s 越来越受到人们的广泛关注和重视,成为当前生物医学领域研究的热门课题。h2s 具有多种生物学效应, 在全身多系统中参与了许多方面的生理及病理生理过程，揭示了某些疾病未知的发病机理，并提出了新的治疗途径，具有广阔的研究前景和应用价值。目前对h2s在心血管循环系统、神经系统及消化系统等的研究已有很大的成果，但在大面积严重烧伤病人脏器保护及与全身炎症反应综合征方面的研究相对缺乏。 本实验旨在探讨h2s对严重烧伤后早期应激反应的抗休克作用，从而为临床重度烧伤患者的疾病演变和治疗提供一条新的思路。
四 、课题设计方案
包括研究工作的主要技术路线、实验方法或资料收集方法、统计处理的方法等：
1.主要技术路线
2.试验方法
1)动物模型制备及分组
78只健康雄性 sd大鼠，体重 200～240 g，购于青海省地方病疾病控制中心。在大鼠适应性喂养1周后，随机分为非烧伤组和烧伤组。烧伤组又分为单纯烧伤组、nahs干预组、ppg干预组。分别设6h、12h、24h、48h组各6只，烧伤组大鼠背部脱毛并乌拉坦麻醉后，仰卧固定在烧伤模型板上，将背部裸露皮肤浸泡在95°c恒温水箱中20秒，制成30%三度烫伤后，立即用纱布拭干水渍，腹腔注射生理盐水40 ml/kg抗休克，自由进食水。nahs干预组补液复苏后腹腔注射硫氢化氢2ml，ppg干预组复苏后腹腔注射ppg2ml。正常对照组大鼠予以背部剃毛及麻醉后浸入 37 cc水浴中假烫 20 s，假烫后不给复苏补液 。单纯烧伤组背部剃毛及麻醉后浸入95 cc水浴中烫 20 s，烫后复苏补液，不给任何干预。
2)大鼠血压、心率的测定。
各组大鼠均在6 h、12 h、24 h、48 h、96 h各时相点内分别随机选取对应大鼠，乌拉坦(100 mg/kg)麻醉下 ，用16道生理测量仪，在颈部颈动脉插管下测定大鼠心率、血压。
3)血标本的采集和处理。
各组大鼠均于取血前 12 h禁食，于6 h、12 h、24 h、48 h、96 h各时相点内分别随机选取对应大鼠，乌拉坦(100 mg/kg)麻醉下 ，剖腹 ，直视下腹主动脉采血 ，每只大 鼠抽血 2 ml，室温 下静置约 20 min后 ，XX转离心 10 分钟，分离出血清 ，置于 一70℃冰箱中冰冻保存，待测。
4)血清硫化氢及各血管活性物质的含量测定
血清中血管活性物质(组胺、p物质)的含量测定采用酶联免疫吸附(elisa)法 ，硫化氢采用比色法测定，操作均按照说明书进行。分别记录每时相点检测血清中各个因子含量 ，比较 各组大 鼠血 清 中硫化氢及c-反应蛋白、il-6、总体抗氧化能力的含量变化。
3.统计学处理方法
采用 spss17.0统计软件进行统计分析。计数资料用例数及百分数表示，计量资料以均数 ±标准差( ±s)表示。率的比较采用卡方检验;不同时相点下各组间均数比较采用方差分析，两组间均数的比较采用 lsd检验;同一时相点两组间比较采用 t 检验 。以 p<0.05表示差异具有统计学意义标准。
五、实施计划进度
20XX.9---20XX.10 文献资料的检索、课题预调查、撰写综述。
20XX.10---20XX.11 药物置备、动物购买、预实验及撰写开题报告。
20XX.11---20XX.1 动物实验研究。
20XX. 1--20XX.2 实验指标检测及数据整理统计、撰写论文。
20XX. 2―-20XX. 4 完成论文，审查论文。
六、预期研究成果
预期结果及其意义：
通过对大鼠烧伤后给予外源性气体信号分子硫化氢(h2s)前后血清血管活性物质(组胺、p物质)和大鼠心率、血压动态变化的对比，表明h2s参与了烧伤休克早期应激的病理生理过程，并有一定的抗休克作用。为严重烧伤早期休克的病理生理变化引入新的理论机制，为烧伤抗炎治疗寻找新的研究方向。
七、估算课题工作量、完成课题的条件
1、仪器设备、人员配备、实验动物、药物试剂等：
(1)仪器设备:
95℃恒温水浴箱;
高转速离心机;
16道生理指标测量仪;
敏感硫电极;
722光栅分光光度计;
酶标仪。
(2)人员配置：
符合条件的实验室及相关技术人员的指导和协助。
(3)实验动物
健康雄性sd大鼠78只，体重200～250 g，青海省地方病疾病控制中心选购。
(4)药物试剂
硫氢化钠(nahs)注射液;ld-炔丙基甘氨酸(ppg)注射液;乌拉坦麻醉剂;大鼠组胺(his)酶联免疫分析试剂盒;大鼠p物质(sp)酶联免疫分析试剂盒;抗坏血酸(c6h8o6);氢氧化钠(naoh);乙二胺四乙酸二钠(edta);na2s・9h2o;l-半胱氨酸;5’-磷酸吡哆醛;磷酸二氢钾;磷酸氢二钾;三氯乙酸;三氯化铁;醋酸锌;对氨基二甲基对苯二胺盐酸盐
2、开展科学研究的经费
项 目经费支出(元)备 注(依据与说明)
一、研究经费
1、科研业务费
(1)测试/计算/分析费
(2)能源/动力费1000
(3)会议/差旅费
(4)出版物/文献信息费500
2、实验材料费
(1)原材料/试剂/分析费2650两个个试剂盒2200元;麻醉剂450元
(2)其他4160实验大鼠、笼具及饲料
3、仪器设备
(1)购置
(2)试剂
4、实验室改装费
二、劳务费
三、合计8310
说明
八、存在的问题及解决的办法措施
1、 预计研究过程中可能遇到的困难和问题：
1)研究经费不足;
2)试剂质量问题;
2)缺少相应的实验设备;
3)专业实验经验不足;
4)动物饲养过程及实验过程中可能出现的误差;
5)不可预知的问题。
2、解决的办法和措施：
1)尽量节省开支及向导师申请资金。
2)严格按照动物饲养要求，每组多预备一只。
3)严格按照文献记载造模并进行预实验;力争掌握成熟的实验操作方法，并可寻求有经验的实验技术人员的指导。
4)完善实验前期的准备工作，参阅相关文献资料，找到相关的理论依据。
5)操作过程力求规范，检测设立标准质控，尽量选同一批号的试剂，药物。
6)向公卫系及高原实验中心寻借仪器。
